納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)：

外泌體表征的重要技術(shù)手段

一、外泌體簡介

在復雜的生物系統(tǒng)中，細胞間的信息傳遞與物質(zhì)交換及功能表達均依賴于一類特殊的載體——外泌體。

外泌體作為細胞外囊泡中重要的亞群，是直徑約 30-150 納米的膜性囊泡，其內(nèi)部攜載著蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性分子，在細胞間通訊網(wǎng)絡中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖1）。研究表明，腫瘤細胞來源的外泌體可通過促進血管生成、誘導免疫抑制微環(huán)境等途徑支持腫瘤進展；神經(jīng)元分泌的外泌體則參與神經(jīng)信號傳導調(diào)控及突觸可塑性維持。這些研究的實現(xiàn)，均依賴于對外泌體物理特性（如粒徑分布、濃度水平）的精準解析。

而納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)作為解析外泌體粒徑與濃度等基本物理特性最為常用的技術(shù)手段之一，對外泌體相關(guān)的科研及醫(yī)療研究發(fā)揮著不可或缺的重要作用。

圖1  外泌體的潛在應用

二、納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)

1、NTA核心工作原理

納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）基于光散射理論與布朗運動分析的有機結(jié)合，實現(xiàn)對外泌體等納米顆粒的精準表征。其核心構(gòu)成及技術(shù)原理如下（圖2）：

圖2  NTA核心結(jié)構(gòu)

納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）通過激光散射光路系統(tǒng)，對溶液中的納米級顆粒進行動態(tài)監(jiān)測。當單束激光聚焦于樣品池時，顆粒的散射光信號被高靈敏度相機捕捉，形成實時動態(tài)圖像。基于Stokes-Einstein方程（圖3），通過追蹤單個顆粒的運動軌跡并進行統(tǒng)計分析，可精確計算顆粒的流體力學直徑及濃度分布。該技術(shù)實現(xiàn)了對 10-1000 納米粒徑范圍顆粒的單顆粒分辨率檢測，尤其適用于異質(zhì)性外泌體群體的表征。

圖3  Stokes-Einstein方程

2、NTA技術(shù)特點

·       高分辨率檢測：可識別 10 納米級粒徑差異。

·       高效率檢測：相比傳統(tǒng)檢測技術(shù)，NTA 顯著縮短檢測周期，從樣本加載到完成分析僅需 5 分鐘，較透射電子顯微鏡（TEM）的 2 小時以上前處理時間，效率大幅提升。

·       可視化數(shù)據(jù)呈現(xiàn)：通過保存顆粒運動的實時影像及散射光強度圖譜，實現(xiàn)檢測結(jié)果的可視化驗證，為數(shù)據(jù)可靠性提供直觀依據(jù)。

·       多場景應用：除了顆粒粒徑、濃度等基本功能外，NTA還能集成熒光模塊和ZETA電位模塊，實現(xiàn)標記樣本檢測和樣本顆粒表面電位檢測的應用能力。

3、NTA與其他外泌體表征技術(shù)的對比優(yōu)勢

外泌體的精準表征是開展基礎研究與臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵前提。作為納米級囊泡檢測的核心技術(shù)，納米顆粒跟蹤分析（NTA）在與其他表征手段的對比中展現(xiàn)出不可替代的優(yōu)勢。

由于技術(shù)原理的限制，其他表征手段存在著一些缺陷：TEM技術(shù)檢測流程復雜，程耗時長（ 4 小時以上），且僅能獲取局部顆粒信息，人工計數(shù)誤差率高（ 15%-20%），難以反映樣本整體分布特征；DLS技術(shù)在多分散體系檢測領(lǐng)域表現(xiàn)不佳，且易產(chǎn)生粒徑分布偏移誤差、在低豐度樣本檢測中誤差顯著增大；流式細胞術(shù)需對目標顆粒進行熒光標記以實現(xiàn)檢測，標記過程可能改變外泌體天然屬性，且僅能提供單一熒光參數(shù)分析。

而NTA 技術(shù)憑借其在精準高效、動態(tài)檢測、無標記分析及可視化驗證方面的獨特優(yōu)勢和對多分散體系檢測的優(yōu)良表現(xiàn)，顯著彌補了傳統(tǒng)外泌體表征技術(shù)的局限性。并且，由于NTA對外泌體檢測沒有任何預處理要求，即直接對提取的原生態(tài)外泌體樣本（最接近生理條件）進行檢測，使得NTA能夠精準刻畫外泌體的物理化學特性，為深入探索外泌體功能機制提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。其在不同應用場景下展現(xiàn)出的精準性與高效性，為后續(xù)在外泌體研究各領(lǐng)域的深入應用奠定了堅實基礎。

基于此，NTA技術(shù)已經(jīng)是外泌體研究不可或缺的一種重要分析手段，以下將通過具體應用案例，進一步展現(xiàn)其在實際研究與臨床實踐中的重要價值。

三、NTA在外泌體研究中的應用案例分析

1、NTA精準檢測外泌體和微囊泡的粒徑與濃度

圖4  案例文獻1

《Nanoparticle tracking analysis monitors microvesicle and exosome secretion from immune cells》研究中（圖4），NTA 被用于監(jiān)測免疫細胞（如 Jurkat T 細胞、樹突狀細胞）在刺激（離子載體、LPS）或抑制（基因敲低、分泌抑制劑）條件下的 EVs 分泌動態(tài)。NTA 可動態(tài)追蹤 EVs 濃度變化，如離子載體刺激使 Jurkat T 細胞 EVs 濃度增加 43%-126%，LPS 激活樹突狀細胞后 EVs 分泌 48 小時達峰值；通過粒徑分布區(qū)分微囊泡（100-1000 nm）與外泌體（30-150 nm），發(fā)現(xiàn)免疫細胞分泌的 EVs 以 70-90 nm 為主（圖5）；結(jié)合抗 CD45 免疫磁珠去除 T 細胞來源 EVs，NTA 信號減少 60%，驗證檢測特異性。該技術(shù)為免疫細胞 EVs 分泌與激活狀態(tài)的關(guān)聯(lián)研究提供了精準的定量工具。

圖5  該案例研究中，NTA測得的外泌體粒徑與濃度

該研究證明，納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)通過單顆粒實時追蹤，能對細胞 EVs實現(xiàn)精準的粒徑與濃度表征， 為EVs相關(guān)的各學科科研工作、及EVs檢測作為技術(shù)手段的臨床醫(yī)療研究提供強有力的技術(shù)支持。

2、NTA技術(shù)為再生醫(yī)學科研提供重要助力

圖6  案例文獻2

在比較 FBS 與 HPL 培養(yǎng)的 MSC-EVs 研究中（圖6），NTA 作為核心表征工具：測定 F-EVs 與 H-EVs 粒徑均約 150 nm，量化 H-EVs 顆粒濃度較 F-EVs 高 1.5 倍，證實 HPL 促進 EVs 分泌；通過顆粒數(shù) / 蛋白質(zhì)量比驗證兩者純度均超 1×10? particles/μg，符合臨床級標準（圖7）；在體外血管生成和體內(nèi)腎損傷模型中，基于 NTA 濃度數(shù)據(jù)實現(xiàn) EVs 給藥劑量的標準化控制。NTA 通過精準量化 EVs 物理特性，為無動物源培養(yǎng)基篩選、EVs 產(chǎn)量評估及功能實驗標準化提供數(shù)據(jù)支撐，推動 MSC-EVs 在再生醫(yī)學中的機制研究與轉(zhuǎn)化應用。

圖7  不同通路的充質(zhì)干細胞（MSCs）及其來源細胞外囊泡（MSC-EVs）的特性分析

該研究證實，NTA技術(shù)通過精準量化外泌體的物理特性，為間充質(zhì)干細胞來源外泌體的研究提供了核心數(shù)據(jù)支撐，其單顆粒追蹤特性為解析 EVs 分泌動力學（如缺氧或藥物刺激下的釋放規(guī)律）提供了量化依據(jù)，推動 EVs 在再生醫(yī)學中的機制研究與標準化轉(zhuǎn)化，成為連接基礎科研與臨床應用的關(guān)鍵技術(shù)橋梁。

3、NTA技術(shù)為臨床醫(yī)療策略和療效評估提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支撐

圖8  案例文獻3

《Enhancing immunogenicity and release of in situ-generated tumor vesicles for autologous vaccines》研究中（圖8），NTA 用于評估 Combo-NPs@shGNE 納米顆粒原位疫苗策略：檢測到該策略使 TEV 釋放率提升至 56.44%（較空白組高 9.57 倍），TEV 濃度達 1.2×10? particles/10? cells，粒徑分布更集中；體內(nèi)腫瘤組織中，NTA 顯示治療組 TEV 顆粒數(shù)較空白組提升 1.32 倍，且與 HSP70 等免疫刺激分子含量正相關(guān)；TEV 濃度數(shù)據(jù)直接關(guān)聯(lián)腫瘤生長抑制率，成為評估疫苗效果的關(guān)鍵參數(shù)（圖9）。NTA 通過量化 TEV 粒徑、濃度及釋放效率，為原位疫苗的機制驗證與療效評估提供了核心技術(shù)支撐。

圖9  NTA測定 TEV 的粒徑分布和粒子數(shù)

在該研究證明，納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)完全能夠作為驗證研究假設和評估治療效果的核心工具，用于細胞外囊泡（包括外泌體）的粒徑分布、顆粒濃度及釋放效率的定量表征，發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

四、總結(jié)

納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)憑借其高分辨率、快速檢測和可視化驗證等優(yōu)勢和對多分散體系檢測的優(yōu)良表現(xiàn)，在外泌體相關(guān)各領(lǐng)域研究中發(fā)揮著不可或缺的重要作用：在基礎研究中，其通過解析外泌體的粒徑分布與濃度特征，助力揭示外泌體在細胞間通訊中的作用機制，如腫瘤細胞外泌體促血管生成、神經(jīng)元外泌體調(diào)控神經(jīng)信號傳導等過程；在再生醫(yī)學領(lǐng)域，NTA 為間充質(zhì)干細胞來源外泌體（MSC-EVs）的培養(yǎng)基篩選、產(chǎn)量評估及質(zhì)量控制提供核心支撐，推動無動物源培養(yǎng)基的臨床轉(zhuǎn)化；在臨床治療策略開發(fā)中，可用于監(jiān)測腫瘤原位疫苗誘導的囊泡釋放效率、評估免疫原性囊泡的粒徑均一性，為個性化疫苗優(yōu)化提供量化依據(jù)；在疾病診斷與療效監(jiān)測方面，NTA 通過動態(tài)追蹤血液、尿液等樣本中外泌體的物理特性變化，為腫瘤早期篩查、病程進展判斷及治療響應評估提供技術(shù)支持；此外，在藥物遞送系統(tǒng)研究中，NTA 可實時監(jiān)測外泌體載藥前后的粒徑變化與濃度波動，輔助優(yōu)化載藥工藝并確保給藥劑量標準化，全面推動外泌體在精準醫(yī)學中的應用。

NTA已成為外泌體研究的不可替代的工具。未來，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新，NTA 必將進一步推動外泌體的基礎研究與臨床轉(zhuǎn)化，在相關(guān)的生物生命科學研究、各類疾病診斷和治療中發(fā)揮更大作用。